4.7.2 ELISA

• La méthode immuno-enzymatique (ELISA) utilise un antigène soluble, qui est attaché aux 96 puits d'une plaque de microtitrage. Ceci permet de traiter un grand nombre d'échantillons à la fois et donne des résultats quantitatifs, lorsque le test est lu à l'aide d'un spectrophotomètre. Dans les situations de terrain, des lecteurs ELISA portables, fonctionnant sur piles, peuvent être utilisés.

• Pour la préparation des extraits solubles de parasites utilisés comme antigène dans l'ELISA, une culture in vitro riche en schizontes (à une parasitémie de 10% ou plus) est centrifugation, les globules rouges sont lavés plusieurs fois, puis lysés dans un tampon hypotonique froid pour libérer l'hémoglobine, laissant les parasites intacts. Les antigènes sont ensuite solubilisés par sonication des parasites ou par congélation-décongélation répétée, suiv d'une centrifugation à haute vitesse pour éliminer les débris non solubles. Le surnageant est utilisé comme stock d'antigène soluble, et conservé en aliquots à -70ßC. La concentration optimale d'antigène sur la plaque ELISA est détermineé par titration croisée (chequer-board titration) envers des sérums positifs et négatifs connus.

• Toutes les 96 cupules d'une plaque de polystyrène sont tapissés d'antigène par incubation à 4ßC d'une dilution optimale de l'antigène soluble dans un tampon carbonate à pH 9.6 (100µl par cupule). Après lavage, les plaques peuvent être utilisées immédiatement ou séchées et conservées à 4ßC pendant plusieurs années. Les sérums à tester, utilisés à une dilution de 1:100 ou 1:200 dans du tampon phosphate contenant 0.05% de Tween 20, sont transférrés dans chacune des cupules de la plaque et incubés pendant 2 heures à température ambiante, puis lavés.

• Une dilution du conjugué enzyme-anti-immunoglobuline humaine, diluée suivant les instructions du fabriquant, est ajoutée à chaque cupule, incubée pendant 2 heures , suivi d'un lavage comme précédemment. Finalement, une solution de substrat fraichement préparée est ajoutée à chaque cupule et incubée jusqu'au changement de couleur du chromogène (la réaction est standardisée en fonction de l'intensité de couleur attendue pour le sérum positif standard utilisé comme contrôle). L'intensité de la couluer dans chacune des cupules peut être évaluée visuellement lorsque le test est utilisé pour un test approximatif mesurant une réaction positive/négative (ou dans des situations de terrain), Normalement, l'absorbanceest mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre utilisant la longueur d'onde appropriée à la couleur du chromogène.

• Les combinaisons conjugué/substrat les plus habituelles sont:

i) phosphatase alcaline-conjuguée à l'anti- immunoglobuline humain avec la para-nitrophenyl phosphate comme substrat de l'enzyme

ii) peroxidase du raifort-conjuguée à l'anti- immunoglobuline humain avec l'ortho-phénylène diamine (OPD) comme substrat.

Les substrats sont disponibles dans le commerce sous des formes facile à utiliser.

Outre les extraits bruts d'antigènes parasitaires, l'ELISA peut utiliser une gamme d'antigènes définis, synthétiques ou recombinant (par exemple les antigènes MSP-1, RESA ou CSP-1). De telles études séro-épidémiologiques sont utiles pour élucider le rôle d'un antigène-cible donné dans l'immunité et la protection contre le paludisme.