4.7.1 IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE

• L'immunofluorescence indirecte (ou IFAT) est l'une des méthodes sérologiques de routine, parce qu'il est relativement facile de préparer des lames d'antigène pour toutes les plasmodies humaines et aussi parce que des lames pour IFAT existent dans le commerce. L'utilisation de P. falciparum de culture est une source d'antigène particulièrement aisée.

• Dans la procédure IFAT, l'antigène consiste de sang infecté attaché à des lames de microscope couverte de téflon et présentant 12-puits. Une goutte de dilution au 1:100 de globules rouges infectés lavés est placée sur chacun des puis, qui est alors laissé à sécher. Une fois sèche, la lame est conservée à -20ßC (ou mieux à -70ßC). Juste avant l'emploi, la lame est décongelée dans une chambre humide pour permettre la lyse des globules rouges, séchée, puis fixée à l'acétone froid (la fixation n'est pas obligatoire). Des dilutions du sérum à tester sont préparées et chacune des dilutions est placée sur l'un des puits. Après une incubation de 30-60 minutes, la lame est lavée dans du tampon phosphate sans détergent. Une goutte de solution de sérum anti-immunoglobuline humaine marquée à l'isothiocyanate de fluoresceine (= le conjugué) contenant 1:10.000 de bleu d'Evans comme contre-colorant. Après incubation et lavage, les lames sont séchées et examinées sur un microscope à fluorescence. Les anticorps présents dans le sérum test se combinent aux antigènes du parasite, permettant au conjugué fluorescent de se combiner aux anticorps et donner une coloration fluorescente aux parasites examinés aux ultraviolets. La présence de fluorescence pour la dernière des dilutions en série à être positive indique le 'titre' de l'anticorps présent. Une fluorescence à une dilution osupérieure à 1:20 est généralement considérée positive. La méthode a l'avantage de au technicien de voir les parasites utilisés comme antigène.

• Bien que les différentes espèces de Plasmodium aient certains antigènes en commun, il est recommandé d'utiliser des antigènes spécifiques d'espèce pour une sensibilité maximum du test. La préparation d'antigènes spécifique est possible dans le cas de l'IFAT, car le sang humain infecté par P. vivax ou P. malariae peut être utilisé comme source d'antigène (dans le cas de P. falciparum, il est nécessaire d'utiliser de sang ayant été en culture pour 24 heures pour obtenir des schizontes ou d'utiliser des souches de culture). Les désavantages de l'IFAT sont: la nécessité de disposer d'un microscope à fluorescence, la subjectivité de la lecture et le fait que la méthode prend du temps, ne peut pas tester un grand nombre d'échantillons à la fois et demande un personnel technique spécialisé.